Biotecnologie dei microrganismi

Cittaro Davide Matr. 567073 ESERCITAZIONE DI BIOTECNOLOGIE DEI MICROORGANISMI Caratterizzazione di nuovi geni ad attività insetticida INTRODUZIONE Obiettivo del lavoro è stato quello di individuare varianti del gene cerA, gene tipico di microorganismi del gruppo di Bacillus cereus che codifica per un enzima ad attività fosfolipasica, attraverso l'analisi di materiale genetico proveniente da campioni di suolo. Pur partendo comunque dal suolo, l'esperimento è stato condotto con due protocolli paralleli che prevedono l'analisi di DNA estratto in un caso direttamente dal suolo e nell'altro da ceppi di B. cereus isolati dal terreno stesso. La prima procedura è stata adottata dal momento che in questo modo si possono screenare anche genomi di microorganismi non coltivabili. 1. ESTRAZIONE DI DNA DAL SUOLO Per ottenere DNA dal suolo abbiamo proceduto con una lisi meccanica utilizzando Glass Beads miscelate a 0,5 g di terreno in tampone fosfato (0,1 M pH 8 Na2HPO4, Na2H2PO4) e ad un apposito tampone di estrazione (NaCl 100 mM, Tris HCl pH 8 500 mM, SDS 10, seguendo un protocollo standard. Attraverso l'agitazione sul vortex le sferette di vetro hanno lisato gran parte dei microorganismi presenti nel campione rilasciando il contenuto cellulare nel mezzo. Con una semplice centrifugata è stato possibile recuperare tale miscela per un volume pari a 400 l. Per poter eliminare la componente proteica in questa miscela abbiamo aggiunto una soluzione di sodio acetato (3 M pH 5) e incubato in ghiaccio. Dopodiché è stato necessario procedere con un'altra centrifuga per recuperare il surnatante. Ciò che abbiamo ottenuto fino ad ora è una miscela di acidi nucleici e composti complessi del terreno, in particolare acidi umici. Per poter continuare a lavorare è necessario eliminare gli acidi umici in quanto sono in grado di inibire gli enzimi polimerasici che saranno utilizzati in seguito per amplificazioni via PCR. Per ottenere DNA puro abbiamo proceduto con una cromatografia su una colonnina utilizzando come matrice sepharose 4B. Parallelamente un altro gruppo ha proceduto alla purificazione utilizzando come matrice PVPP. L'utilizzo di due differenti matrici è stato necessario per poter valutare in seguito quale sia più efficiente nella separazione. Caricata la colonna con 200 l di campione grezzo abbiamo proceduto con l'eluizione di 10 frazioni con 100 l di tampone di eluizione (TE: Tris HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM). Il rimanente campione grezzo e le 10 eluizioni sono stati analizzati allo spettrofotometro, valutando la OD a 260 nm. I risultati di tale analisi sono riportati nel grafico 1. Di tale grafico è da rilevare il valore ottenuto in corrispondenza della frazione n. 8 che pare essere assolutamente errato in quanto non in linea con i valori relativi alle frazioni fiancheggianti; molto probabilmente questo deriva da una errata preparazione della soluzione all'interno della cuvetta. Abbiamo proceduto allora alla preparazione di una elettroforesi in gel di agarosio al Continua »