Biologia molecolare

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Enzimi di restrizione, trascrizione (procarioti), elettroforesi, regolazione della trascrizione (3 pagine formato doc)

Enzimi di restrizione

Oltre alle mutazioni ci sono anche altri marcatori genetici: i siti di riconoscimento per enzimi di restrizione.

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi specifiche, che riconoscono ognuno una sequenza specifica di DNA, lunga da 4 a 8 nucleotidi.

Gli enzimi di restrizione proteggono la cellula batterica dai virus degradando il DNA virale. Le sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione, qualora occorrano nel genoma batterico, sono protette dalla degradazione da una metilazione in A o in C; ove queste sequenze si trovino in un DNA estraneo, non sono in genere metilate e vengono quindi tagliate dalle nucleasi di restrizione.

Se una mutazione cade fuori da un gene, non si nota. I siti di riconoscimento per gli enzimi di restrizione sono ravvisabili anche fuori dai geni.
Essi ci permettono la mappatura di tratti più o meno estesi di DNA.


Identificando i siti di restrizione, siamo in grado di capire dove gli enzimi di restrizione taglieranno.


Elettroforesi su gel di DNA => la velocità di migrazione è inversamente proporzionale alla dimensione della molecola di DNA. Essa ci permette di quantificare la dimensione di un frammento di DNA tagliato da enzimi di restrizione. Se muta una (o più) base in un sito di riconoscimento per enzimi di restrizione, ci sarà un taglio in meno, e il frammento di DNA sarà più lungo.

DNA polimerasi I di E. Coli => costituita da una subunità, formata da 3 domini:

·         DNA polimerasi

·         Esonucleasi 3'=> 5'

·         Esonucleasi 5'=> 3'

 

Se si rimuove il terzo dominio => frammento di Klenow Þ è usato il laboratorio perché molto più veloce, anche se perde la capacità di esonucleasi 5'=> 3'.


Nick translation => serve per sintetizzare filamenti di DNA marcati radioattivamente. E' il Pi a ad essere marcato radioattivamente (i Pi b e g vengono rimossi nella sintesi del legame fosfodiesterico). Si usa la DNAsi I, che forma un nick in 3'-OH di un nucleotide. La DNA polimerasi I allunga il nick, rimuovendo i nucleotidi pre-esistenti. Alla DNA polimerasi I si forniscono nucleotidi marcati. Dopo un po', essa si fermerà e lascerà un altro nick (=> nick translation), perché non riesce a procedere più di tanto. Il nick verrà poi saldato dalla DNA ligasi.