L'invertasi:esperienza di laboratorio

RELAZIONE DEL LABORATORIO DI CHIMICA DELLE FERMENTAZIONI RELAZIONE DEL LABORATORIO DI CHIMICA DELLE FERMENTAZIONI TITOLO: INVERTASI E POTERE ROTATORIO DEGLI ZUCCHERI CENNI TEORICI: Il saccarosio è lo zucchero più comune esistente, ha delle caratteristiche particolari: non è un riducente, non forma osazone, non esiste in forme anomere e in soluzione non mostra il fenomeno della mutarotazione; in quanto in (+)-saccarosio non contiene né gruppo aldeidico né gruppo chetonico libero. In idrolisi con acidi diluiti o per azione dell'enzima dell'invertasi forma uguali quantità di D(+)-glucosio e di D(-)-fruttosio; inoltre l'idrolisi comporta una variazione del senso di rotazione dello zucchero, da positivo a negativo (da qui il nome di inversione dello zucchero). La miscela di zuccheri ottenuta prende il nome di zucchero invertito. L'invertasi è un enzima che catalizza l'idrolisi di determinati legami glicosidici, si trova nel lievito, nei germogli e nelle foglie di parecchie piante e le api forniscono invertasi infatti lo zucchero invertito è contenuto nel miele. POTERE ROTATORIO SPECIFICO D saccarosio +66.5° D glucosio +52.7° D fruttosio -92.4° Prodotto d'inversione -19.9° MATERIALI e APPARECCHIATURE: Polarimetro Tubi polarimetrici da 1 a 2 dm Bagno termostatico a 37°C N^4 palloni tarati da 100 ml N^1 bagnomaria per provette N^4 provette N^2 pipette a siringa da 5 ml REATTIVI: Saccarosio Invertasi o ?fructosidasi UI=150000/500 mg Tampone citrato pH 4.66 o tampone acetato pH 5 Soluzione Fehling A e B Acido cloridrico conc. NaOH 20% La soluzione di ?-fructosidasi viene preparato dall'enzima liofilizzato UI= unità internazionale è la quantità di enzima che catalizza la conversione di una micromole (10-6 moli) di substrato a prodotto in un minuto a 25°C e a pH ottimale. La temperatura a cui noi lavoreremo con il nostro enzima è 37°C e a pH tamponato a 5. Attività specifica è il numero di micromoli di substrato usato o di prodotto formatosi in ogni minuto x mg di enzima. PROCEDIMENTO: Si sciolgono 10g di saccarosio in un pallone da 100 ml con acqua distillata, si porta a volume e si misura il potere rotatorio a 20°C con il polarimetro. Si sciolgono ancora 10 g di saccarosio in un pallone da 100 ml con 50 ml di acqua distillata, si aggiungono 5 ml di acido cloridrico concentrato e si mette a bagnomaria per 5 minuti a una temperatura di 65°C, agitando di tanto in tanto. Successivamente si raffredda sotto acqua corrente fredda e si introducono 10 ml di NaOH al 20% per neutralizzare l'acido, si porta a volume e infine si legge al polarimetro. Si pesano un terzo e un quarto campione di saccarosio da 10 g l'uno, si trasferiscono con un po' d'acqua distillata nei rispettivi palloni da 100mle si aggiunge ad ognuno la quantità di invertasi calcolata, sciolta in un determinato volume di soluzione tampone a pH 5. Il terzo campione viene messo ad incubare per 15 minuti a 37°C, scaduto il tempo si introduce una soluzione satura di Na CO 5 ml per bloccare l'attività del