INGEGNERIA GENETICA e VETTORI DI CLONAGGIO

Appunto inviato da sweetady
/5

Modificazione dell’ingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico (11 pagine formato doc)

Untitled Ingegneria genetica Modificazione dell'ingegneria genetica di un organismo attraverso la deliberata manipolazione del suo materiale genetico.
Ricerca di base: purificare, esprimere, amplificare geni. Utilizzata Ricerca applicata/commerciale (biotecnologie): sviluppo microrganismi ingegnerizzati per la produzione di specifiche sostanze (ormoni, vaccini, farmaci, proteine). Per poter manipolare un gene è necessario CLONARLO: isolarlo, purificarlo e farlo esprimere (ovvero tradurlo in un sistema più comprensibile per l'operatore). Gli strumenti dell'ingegneria genetica sono: Vettori di clonaggio (utilizzati per portare le sequenze di DNA in batteri ricettivi e per amplificare la sequenza desiderata) sono i plasmidi. Servono per inserire DNA esogeno al loro interno e al tempo stesso essere in grado di replicarsi nella cellula ospite.
I vettori plasmidici sono pUC, pBR 322, pGEM e sono formatida circa 20 Kb; i batteriofagi, come lambda, costituiti da circa 25 Kb; cosmidici costituiti fino a 45 Kb. Enzimi di restrizione servono per tagliare in modo riproducibile il DNA da amplificare in punti precisi allo scopo di inserirlo nei vettori (sono le endonucleasi di restrizione). Riconoscono sequenze specifiche di DNA che sono rappresentate da 4-5 basi e tagliano solo quando ci sono questi indicatori. I siti di taglio sono specifici e si hanno solo in presenza di una sequenza 5 basi. DNA ligasi: è il processo inverso in grado di unire molecole lineari di DNA riformando l'unità della catena nucleotidica. Vettori di clonaggio Piccole, ben caratterizzate molecole di DNA; Contengono almeno un sito d'inizio (ori) replicazione nell'ospite prescelto; Contengono uno o più geni che ne consentano l'identificazione; PLASMIDICI: Replicano indipendentemente; Piccole dimensioni; DNA circolare (stabile durante la manipolazione); Multiple copie per cellula; Trasportano geni per la resistenza agli antibiotici; Introdotti in batteri mediante trasformazione/elettroporazione (costosa, solo per alcuni batteri); Rimosso operone tra; Siti per azione endonucleasi di restrizione (siti di taglio per gli enzimi, detto sito di policlonaggio - multiple cloning site). Danno le estremità a cui far aderire il DNA da clonare. Gli enzimi di restrizione (endonucleasi): riconoscono una sequenza sitospecifica nelle molecole di DNA se: taglio sfalsato nella molecola di DNA generano estremità coesive (stikcy ends); è più facile l'inserimento; taglio non sfalsato nella doppia elica di DNA generano estremità piatte (blunt ends); non c'è l'appaiamento delle basi e il plasmide non tende a richiudersi. L'opera delle ligasi è più complicata. Un gene non viene manipolato direttamente (per esempio un gene costituisce lo 0.05% del genoma E. coli), ma si utilizzano dei passaggi intermedi per aumentarne la quantità e facilitarne la manipolazione >>clonaggio. Isolamento e frammentazione DNA. Introdurre frammento desiderato. Introdurre e mantenere il frammento clonato in ospite intermedio. Identific