L'uso dello spettrofotometro per il dosaggio delle proteine

DOSAGGIO DELLE PROTEINE

Il dosaggio delle proteine: lo spettrofotometro. Lo spettrofotometro è uno strumento che serve per valutare quantitativamente l’intensità della luce trasmessa o assorbita della sostanza in esame alle diverse lunghezze d’onda dello spettro visibile.

Tali lunghezze d’onda dipendono dalla sostanza esaminata.
Il meccanismo di funzionamento può essere schematizzato in 5 parti:
- La luce visibile passa attraverso un monocromatore ed è scomposta nei colori dello spettro
- Il monocromatore è fatto ruotare in modo tale da avere la luce di una determinata lunghezza d’onda (e quindi di un colore) passante per una fessura presente su uno schermo
- La luce passa attraverso la fessura e viene assorbita dalla soluzione in esame, contenuta in apposite vaschette larghe 1 cm, dette ‘cuvette’
- La luce non assorbita, cioè trasmessa, viene registrata da un rivelatore, che consiste di una fotocellula che trasforma la luce in un segnale elettrico
- Il segnale elettrico viene mandato ad un amplificatore che fa spostare l’ago di un galvanometro, in modo tale da dare direttamente il valore della luce assorbita (assorbanza) o trasmessa (trasmittanza).

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QUANTIFICAZIONE PROTEINE SPETTROFOTOMETRO

Lo spettrofotometro determina inoltre la concentrazione di un soluto attraverso la sua capacità di assorbire luce a determinate lunghezze d’onda. Ciò è possibile perché la legge di Lambert-Beer afferma che la luce passante attraverso un mezzo colorato viene assorbita in quantità direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza.

A tal proposito quindi, possiamo scrivere la formula matematica che definisce l’assorbanza di una soluzione, cioè la quantità di luce assorbita nell’unità di tempo:

A = a · s · c

in cui a è ‘l’assorbività’ , costante della sostanza ad una certa lunghezza d’onda; s è il cammino ottico della soluzione; c è la concentrazione della sostanza nella soluzione.
Un’altra espressione matematica che rispetta la legge di Lambert-Beer è la cosiddetta “densità ottica”, cioè:
log Iâ—¦/ I = K · C
in cui Iâ—¦ è l’intensità della luce incidente e I è l’intensità della luce trasmessa.