Dosaggio proteico: il metodo di Bradford

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La quantificazione delle proteine presenti in una soluzione mediante la tecnica del dosaggio proteico (4 pagine formato doc)

DOSAGGIO PROTEICO: METODO DI BRADFORD

Dosaggio proteico. Scopo: quantificare le proteine presenti in una soluzione.
Cenni teorici: per determinare la quantità di proteina (BSA) presente nella soluzione abbiamo misurato la sua concentrazione tramite la tecnica della spettrofotometria che permette il riconoscimento e la quantizzazione di una sostanza in base al suo spettro di assorbimento della luce.
Lo spettrofotometro (strumento utilizzato per tale tecnica) è costituito da tre elementi fondamentali: una sorgente luminosa che dà origine ad una radiazione policromatica in un certo intervallo di lunghezze d’onda, un monocromatore che seleziona una lunghezza d’onda determinata e un rivelatore sul quale incide il raggio emergente dalla soluzione in esame trasformando tale segnale in energia elettrica.
 

L'uso dello spettrofotometro per il dosaggio proteico

QUANTIFICAZIONE PROTEINE SPETTROFOTOMETRO

’elaborazione dei dati ci fornisce il valore dell’assorbanza definita come una grandezza che permette di quantificare l'entità dell'assorbimento della luce da parte del campione.
Assorbanza e concentrazione sono legate fra loro dalla legge di Lambert-Beer:
A= ε ×l ×c
In cui:
A = assorbanza
Ɛ = coefficiente di estinzione molare
l = lunghezza della cuvetta (1 cm)
C = concentrazione della soluzione
Con i dati ottenuti si può costruire un grafico concentrazione (della proteina) vs assorbanza tramite il quale è possibile estrapolare il valore della concentrazione desiderato.
 

Riconoscimento delle proteine negli alimenti: esperimento in laboratorio

METODO BRADFORD PROTEINE

Dato che il legame peptidico assorbe a valori molto bassi e nello stesso range dell’acqua, la lettura allo spettrofotometro risulterebbe difficoltosa in quanto non si riuscirebbe a distinguere le due sostanze. È quindi necessario utilizzare un metodo per far assorbire solo la proteina: il metodo di Bradford. Questo metodo utilizza un reattivo, il Coomassie Brilliant Blue, che legandosi ai gruppi amminici e carbossilici, in particolare all’arginina, conferisce una colorazione blu alla soluzione in base alla concentrazione delle proteine in essa contenute. Il picco di assorbanza del colorante è a 595 nm.
Procedimento: per eseguire la nostra esperienza abbiamo avuto bisogno di sei diluizioni a diversa concentrazione della proteina BSA (stock solution 1,45 ± 0,01 mg/ml).
 

METODO COLORIMETRICI PROTEINE

Mediante la formula C_1×V_1 = C_2 × V_2 abbiamo determinato i volumi di proteina e di acqua necessari per arrivare alle concentrazioni desiderate in un volume finale di 400 µl; li abbiamo introdotti in seguito in 6 eppendorf e vortexato in modo da favorirne il mescolamento. Abbiamo poi preparato 7 test tube: 6 in cui abbiamo inserito 100 µl delle nostre concentrazioni e 5 ml di colorante Coomassie Brilliant blue sotto cappa, e nella rimanente (un bianco) 100 µl di acqua e 5 ml del colorante. Tutte le provette sono state vortexate e lasciate ad incubare per 5 minuti in modo da permettere alla reazione di avvenire.